Pojmom optické metódy sa označuje súbor fyzikálno-chemických metód, ktorých spoločným znakom je sledovanie javov pri interakcii hmoty s elektromagnetickým žiarením. Tento názov pochádza ešte z obdobia, kedy sa v analytickej praxi využívalo prevažne elektromagnetické žiarenie vo viditeľnej časti spektra. V súčasnosti sa súbor optických metód rozrástol o postupy pracujúce s elektromagnetickým žiarením v podstatne širšom rozsahu vlnových dĺžok, a to od žiarenia röntgenového až po rádiofrekvenčné. Na obrázku 1 je znázornené celé spektrum elektromagnetického žiarenia.
Obr. 1. Spektrum elektromagnetického žiarenia
ROZDELENIE OPTICKÝCH METÓD:
Spektrálne, ktoré sú založené na výmene energie medzi látkou a žiarením. Spektrum je závislosť veličiny, ktorá je mierou intenzity žiarenia vysielaného alebo prejdeného cez vzorku napríklad pri určitej vlnovej dĺžke žiarenia - l.
Nespektrálne, kde sa nesleduje výmena energie medzi látkou a žiarením, ale sledujú sa zmeny niektorých vlastností žiarenia (napríklad: zmena rýchlosti žiarenia, otáčanie roviny polarizovaného svetla a rozptyl svetla).
ROZDELENIE SPEKTRÁLNYCH OPTICKÝCH METÓD:
1. podľa typu interakcií elektromagnetického žiarenia:
a) s atómami (atómová absorpčná resp. emisná spektrometria a atď...),
b) s molekulami (molekulová absorpčná spektrofotometria a atď...).
2. podľa pôvodu analytického signálu na metódy:
a) emisné - atómy, alebo molekuly emitujú (vysielajú) žiarenie,
b) absorpčné - atómy, alebo molekuly absorbujú (pohlcujú) žiarenie,
c) fluorescenčné - atómy, alebo molekuly absorbujú a vzápätí emitujú žiarenie,
d) rezonančné - pri vysielaní žiarenia s premenlivou frekvenciou sa niektoré frekvencie
zosilnia.
Pre pochopenie základných dejov pri interakcii elektromagnetického žiarenia s látkou je potrebné vedieť, že elektromagnetické žiarenie má dualistický charakter
1. Vlnový charakter: je to vlnenie zložené z elektrického poľa (oscilácia vektora elektrického poľa E) a na neho kolmého magnetického poľa (oscilácia vektora magnetického poľa H). Kde vlnová dĺžka, l je lineárna vzdialenosť medzi dvomi bezprostredne za sebou idúcimi maximami resp. minimami (obrázok 2).
Obr. 2. Vlnový charakter elektromagnetického žiarenia
Ďalšie parametre vlny sú:
Amplitúda, A je dĺžka elektrického vektora v maxime vlny.
Frekvencia (kmitočet) n je počet oscilácií poľa za jednotku času [Hz = s-1]:
Vlnové číslo (vlnočet) je počet vĺn pripadajúcich na vzdialenosť rovnú 1 cm:
2. Korpuskulárny charakter: je to tok diskrétnych častíc - fotónov (svetelných kvánt).
Fotón je najmenšie množstvo elektromagnetického žiarenia pri danej frekvencii. Jeho pokojová hmotnosť je nulová.
Energia fotónu je daná vzťahom:
kde, h - Planckova konštanta 6,6256 ×10-34 J s; n - frekvencia žiarenia; c - rýchlosť svetla vo vákuu 2,9976 ×108 m s-1 a m je hmotnosť fotónu.
MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIA
Molekulová spektrometria predstavuje tú časť spektrometrie, ktorá sa zaoberá meraním a interpretáciou spektier molekúl látok.
MOLEKULOVÁ ABSORPČNÁ SPEKTROMETRIA V ULTRAFIALOVEJ A VIDITEĽNEJ OBLASTI
Molekulová absorpčná spektrometria v ultrafialovej a viditeľnej oblasti (UV-VIS) sa zaoberá meraním a vyhodnocovaním elektrónových absorpčných spektier molekúl látok, ktoré absorbujú elektromagnetické žiarenie v rozsahu vlnových dĺžok 200 až 800 nm. Pri absorpcii UV-VIS svetla dochádza v molekulách látok k excitácii vonkajších (väzbových) elektrónov. Látky, ktoré absorbujú UV žiarenie (l < 380 nm), sa javia ľudskému oku ako bezfarebné látky. Látky, ktoré absorbujú biele slnečné žiarenie (VIS, 380 – 780 nm) sa javia ľudskému oku ako farebné látky.
ELEKTRÓNOVÉ ABSORPČNÉ SPEKTRÁ
Elektrónové absorpčné spektrá zahŕňajú oblasť vlnovej dĺžky žiarenia v rozsahu od 50 do 1000 nm, najmä však UV-VIS oblasť. V UV-VIS oblasti elektrónových spektier sa pracuje so žiarením takej energetickej hodnoty (DE ≈ 150 – 600 kJ mol-1), ktorá má schopnosť premiestňovať vonkajšie (valenčné) elektróny v molekule. Preskok elektrónov nastáva z energeticky chudobnejších molekulových orbitálov na orbitály energeticky bohatšie. Zotrvanie elektrónov v energeticky bohatšom stave je krátke (10-9 s) a pri prechode do základného stavu elektrón môže prechádzať rôznymi deexcitačnými prechodmi (nežiarivými aj žiarivými). Súčasne nastáva aj excitácia vibračných a rotačných stavov molekuly. Zmena celkovej energie molekuly DEM potom zahŕňa zmeny energie elektrónov DEe, zmeny vibračnej energie DEv a zmeny rotačnej energie DEr:
DEM = DEe + DEv + DEr =hn
Zmeny energie elektrónov (DEe ≈ 150 – 600 kJ mol-1) sú však spravidla omnoho väčšie ako vibračnej energie (DEv ≈ 2 – 60 kJ mol-1) a rotačnej energie (DEr ≈ 3 kJ mol-1), takže rozlišovať ich možno len pri špeciálnych podmienkach ako jemnú štruktúru príslušného spektra.
Ako vidieť na obrázku 3, absorpčné prechody látky môžu prebiehať z rôznych vibračných a rotačných stavov základného elektrónového stavu molekuly do rôznych vibračných a rotačných stavov jej excitovaného elektrónového stavu. Všetky zmeny vibračnej a rotačnej energie sa pripočítajú k energii preskoku elektrónov a vzniká celá sústava spektrálnych čiar, ktorých vlnová dĺžka sa líši len v malej miere. Čiarové spektrá (kvantový charakter absorpcie žiarenia) sa prekrývajú a v spektre sa to prejavuje ako molekulový absorpčný pás.
Obr. 3. Vznik molekulového absorpčného pásu
EXPERIMENTÁLNE USPORIADANIE
Meranie absorpcie v UV-VIS oblasti spektier sa vykonáva na rôznych typoch prístrojov, ako kolorimeter, fotometer a spektrofotometer. Fotometer je zariadenie na meranie žiarivej energie alebo pomeru žiarivej energie dvoch lúčov.
V súčasnosti najpoužívanejší prístroj je spektrofotometer, ktorý umožňuje získať spektra v UV-VIS oblasti. Na obrázku 4 je znázornená základná schéma dvojlúčového spektrofotometra.
Obr. 4. Schéma dvojlúčového spektrofotometra
Zdroj žiarenia vysiela polychromatické žiarenie (pre UV oblasť sa používajú vodíkové resp. deutériové výbojky a pre VIS oblasť sa používajú volfrámové resp. halogénové žiarovky), ktoré sa na difrakčnej mriežke monochromátora rozkladá a vzniknuté spektrum sa odráža od zrkadla a premieta sa na zadnú stenu monochromátora. Otáčaním mriežky je možné dosiahnuť, aby cez výstupnú štrbinu monochromátora vychádzal lúč o požadovanej vlnovej dĺžke. Lúč prechádza cez absorbujúce prostredia, ktoré sú realizované kyvetami s konštantnou vnútornou hrúbkou absorbujúcej vrstvy od 0,1 do 10 cm. Do jednej kyvety sa umiestni referenčný roztok (zvyčajne je to čisté rozpúšťadlo resp. slepý roztok) a detektor registruje žiarenie o intenzite I0. V druhej kyvete je roztok analyzovanej vzorky a na detektor potom dopadá žiarenie o intenzite I. Objektívne hodnotenie veľkosti absorbancie sa uskutočňuje použitím fotoelektrických detektorov (fotočlánkov) citlivých na UV-VIS žiarenie. Signály z detektora sa pomocou analógovo-digitálneho prevodníka prevedú do počítača, ktorý využitím vhodného programu vyhodnotí analýzu. Ak sa zisťuje priebeh krivky priepustnosti difrakčná mriežka sa otáča a cez výstupnú štrbinu monochromátora postupne vystupujú lúče s klesajúcou vlnovou dĺžkou, ktoré zahŕňa celú spektrálnu oblasť. Pre prácu vo VIS oblasti spektra sa využívajú kyvety zo skla a pri práci v UV oblasti sa používajú kyvety z kremeňa (SiO2).
Absorpciu žiarenia látkami len vo viditeľnej časti spektra (380 – 780 nm) môžeme subjektívne pozorovať aj vlastnými očami. Absorpcia v tejto oblasti spektra sa nám javí ako farebnosť látky. Farebná látka absorbuje (pohlcuje) z bieleho (viditeľného) svetla len žiarenie takej vlnovej dĺžky (takej farby), ktorá je doplnkovou (komplementárnou) farbou k farbe látky samotnej. Na tomto jave bola založená najstaršia a najjednoduchšia metodika, kolorimetria, kde detekcia veľkosti absorpcie bola robená ľudským okom. Maximálna spektrálna citlivosť ľudského oka je pri vlnovej dĺžke 550 nm. V súčasnosti sa kolorimetria používa ako orientačná metóda, pomocou ktorej je možné relatívne porovnávať intenzitu zafarbenia roztokov vzoriek a štandardov v celom rozsahu VIS spektra (v komparátoroch).
Na obrázku 5 sú uvedené vlnové rozsahy a farby absorbovaného VIS žiarenia a súčasne doplnkové farby, v akých vidíme látky (napr. zafarbenie roztoku) pri pohltení svetla uvedenej vlnovej dĺžky
Obr. 5. Farby absorbovaného žiarenia v závislosti od vlnovej dĺžky a ich doplnkové farby
ANALYTICKÉ VYUŽITIE
Molekulová absorpčná spektrometria v UV-VIS oblasti sa využíva v organickej a anorganickej kvantitatívnej a kvalitatívnej analýze.
KVANTITATÍVNA ANALÝZA
Miera prepusteného, alebo pohlteného žiarenia sa najčastejšie vyjadruje parametrami ako je transmitancia (priepustnosť) T a absorbancia (pohltenie) A.
Transmitancia T je pomer intenzity absorbovaného žiarenia I a intenzity pôvodného žiarenia I0:
Absorbancia A je definovaná ako:
Závislosť transmintancie na vlnovej dĺžke dopadajúceho žiarenia λ sa nazýva krivkou priepustnosti a závislosť absorbancie na vlnovej dĺžke dopadajúceho žiarenia λ sa nazýva absorpčné spektrum. Na obrázku 6 je znázornené absorpčné spektrum a krivka priepustnosti tej istej látky.
Obr. 6. Absorbancia vs. transmitancia
Maximum absorpcie Amax (Tmin) zodpovedá vlnovej dĺžke, pri ktorej sa dá vykonať kvantitatívna analýza. Pre kvantitatívnu analýzu platí už spomenutý Lambertov-Beerov vzťah, podľa ktorého absorbancia A je úmerná mólovému absorpčnému koeficientu ελ (špecifický pre každý druh molekúl a vlnovú dĺžku), dĺžke absorbujúcej vrstvy l a koncentrácii analyzovanej látky c:
Ak sa stanovujú rovnaké druhy látok ελ v rovnakých kyvetách l vzťah sa zjednoduší:
V prípade ak analyzovaný roztok obsahuje viacej analytov o rôznych koncentráciách, pri ich stanovení sa využíva aditívna vlastnosť absorbancie. V takomto prípade je výsledná absorbancia, pri zvolenej vlnovej dĺžke, súčtom absorbancií všetkých zložiek v roztoku:
KVALITATÍVNA ANALÝZA
Poloha absorpčných pásov v UV-VIS spektrofotometrii je daná absorbovanou energiou pri elektrónovom prechode a súvisí so štruktúrou látky. V kvalitatívnej analýze sa ultrafialové a viditeľné (UV-VIS) spektrá látok vhodne doplňujú informácie pri identifikácii neznámych organických látok a pri riešení štruktúrnych otázok z merania infračervených, NMR a hmotnostných spektier a to porovnávaním zmeraného priebehu UV-VIS spektra so známymi spektrami.
METÓDA VYHODNOTENIA
Metóda kalibračnej krivky je najpoužívanejšia a najvhodnejšia metóda na stanovenie koncentrácie analytu. V prípade analýzy série podobných vzoriek pre každý analyt je potrebné zostrojiť zvláštnu kalibračnú závislosť. Kalibračná závislosť pre analyt sa získava meraním signálov analytu v roztokoch S, ktoré majú rovnaké priemerné zloženie ako vzorky, ale s odstupňovanou, známou koncentráciou analytu c. Kalibračné závislosti prechádzajú počiatkom osí a až po určitú koncentráciu majú lineárny charakter. Oblasť nad touto koncentráciou sa obyčajne už nevyužíva pre odčítanie príslušnej koncentrácie, nakoľko odčítanie je zaťažené veľkou neistotou. Preto sa často využíva postup riedenia vzoriek, ktorých signál presiahol bod určený hodnotou c. Zriedená vzorka musí mať signál, ktorý sa dá vyhodnotiť pomocou lineárnej oblasti kalibračnej závislosti. Priebeh kalibračnej závislosti zahŕňa vplyv matricového efektu na meraný signál.
Obr. 7 metóda kalibračnej krivky
STEM
