Chromatografia je separačná metóda, v ktorej sa jednotlivé zložky vzorky počas transportu v chromatografickom prostredí prerozdeľujú (distribuujú) v rôznej miere (podľa vzájomnej afinity) medzi dve fázy, z ktorých jedna je nepohyblivá (stacionárna fáza), zatiaľ čo druhá - pohyblivá (mobilná) fáza sa pohybuje cez stacionárnu fázu definovaným smerom. Všeobecne majú obidve tieto fázy nejednotnú mikroheterogénnu povahu. Svojím určením je chromatografia predovšetkým kvalitatívna a kvantitatívna metóda na analýzu organických aj anorganických látok nepolárnej, polárnej resp. iónovej povahy prítomných vo vzorkách vo vysokých aj nízkych koncentráciách.

Chromatografický proces je výsledkom početného opakovania sa základných dejov sorpcie a desorpcie počas pohybu zložiek lôžkom pórovitej stacionárnej fázy, ktoré je v kolónových technikách valcovité a v tenkovrstvových technikách plošné.

Separáciu (vzájomné oddelenie) jednotlivých zložiek vzorky spôsobujú rozdiely vo veľkosti distribučných konštánt v systéme zvolených fáz.

Rozdelenie chromatografických metód

Chromatografické metódy je možné rozdeliť na základe rôznych klasifikačných kritérií:

1. skupenstvo, v ktorom sa nachádza mobilná fáza

Plynová chromatografia (Gas Chromatography, GC); mobilnou fázou je plyn.

Kvapalinová chromatografia (Liquid Chromatography, LC); mobilnou fázou je kvapalina.

Superkritická fluidná chromatografia (Supercritical-Fluid Chromatography, SFC); mobilnou fázou je látka v nadkritickom stave.

 

2. fyzikálno-chemický dej, ktorý prevláda pri separácii

Adsorpčná kvapalinová chromatografia (Liquid-Solid Chromatography, LSC); zložky vzorky sa separujú na základe ich rôznej schopnosti viazať sa (adsorbovať sa) na povrch stacionárnej fázy (tuhá látka).

Rozdeľovacia kvapalinová chromatografia (Partition Liquid Chromatography resp. Liquid-Liquid Chromatography, LLC); zložky vzorky sa separujú na základe ich odlišnej rozpustnosti v stacionárnej (kvapalina) a mobilnej fáze (kvapalina, resp. plyn).

Iónovo-výmenná chromatografia (Ion-Exchange Chromatography, IEC); zložky vzorky sa separujú na základe rôzne veľkých elektrostatických príťažlivých síl medzi elektricky nabitými funkčnými skupinami stacionárnej fázy (iónomenič) a iónmi vzorky.

Afinitná chromatografia (Affinity Chromatography, AC); stacionárna fáza je schopná viazať zo vzorky len určité zložky, ku ktorým má selektívny vzťah (afinitu) daný usporiadaním funkčných skupín v trojrozmernom priestore.

Gélová chromatografia (Gel Chromatography); zložky vzorky sa separujú podľa svojej veľkosti v pórovitej stacionárnej fáze (gél). Menšie molekuly vzorky sa v póroch gélu zadržiavajú dlhšie (molekulový sieťový efekt) ako makromolekuly.

3. podľa geometrie usporiadania stacionárnej fázy

Kolónová chromatografia; stacionárna fáza je umiestnená v kolóne.

Plošné techniky

Papierová chromatografia (Paper Chromatography, PC); stacionárna fáza je súčasťou chromatografického papiera.

Tenkovrstvová chromatografia (Thin Layer Chromatography, TLC); pórovitá stacionárna fáza je umiestnená na pevnom planárnom (plochom) podklade, napr. hliníkovej fólii alebo sklenenej doske.

4. podľa spôsobu získania chromatogramu

Elučná chromatografia; založená na jednorazovom nadávkovaní vzorky do kolóny a jej následnom vymývaní mobilnou fázou. Objem vzorky dávkovaný na kolónu je cca. do 1 % objemu kolóny. V praxi sa táto technika používa najviac.

Frontálna chromatografia; založená na kontinuálnom privádzaní vzorky do kolóny v mobilnej fáze. Objem dávkovanej vzorky je mnohonásobne vyšší ako objem kolóny.

Vytláčacia chromatografia; založená na dávkovaní vzorky do kolóny, podobne ako pri elučnej technike, pričom ako mobilná fáza sa používa roztok vytláčadla v rozpúšťadle. Objem vzorky dávkovaný na kolónu až 50 % objemu kolóny.

Papierová chromatografia

Papierová chromatografia patrí usporiadaním experimentu k plošným chromatografickým technikám. Na rozdiel od TLC, pri ktorej je vrstva sorbentu nanesená na vhodnej podložke (sklo, plastová fólia, hliníková fólia), je papier vďaka vláknitej štruktúre celulózy samonosný. Separácia je založená na opakovanom rozdeľovaní chromatografovanej látky medzi dve fázy, z ktorých jedna je nepohyblivá (stacionárna) a druhá sa pohybuje (mobilná fáza). V prípade papierovej chromatografie sa zložky vzorky rozdeľujú medzi dve navzájom nemiešateľné kvapalné fázy (rozdeľovacia chromatografia), z ktorých jedna je kvôli interakciám vnútri pórov stacionárnej fázy tiež nepohyblivá. Na celulóze sa z inak homogénnej mobilnej fázy prednostne zadržiava polárnejšia zložka - obyčajne voda, ktorá takto vnútri pórov celulózy vytvára kvapalné prostredie s odlišným zložením ako má mobilná fáza.

Mobilná fáza sa pohybuje vo vrstve stacionárnej fázy účinkom kapilárnych síl, vzlínaním. Pohybom mobilnej fázy sú zložky vzorky unášané v smere pohybu tejto fázy a opakovane, kontinuálne a v rôznej miere danej ich chemickou a štruktúrnou odlišnosťou sú zachytávané interakciami so stacionárnou fázou. Viacnásobným opakovaním tohto procesu môže dôjsť k vzájomnému odlíšeniu chromatografovaných látok. Pri separácii farebných látok pozorujeme výsledok týchto dejov ako rôzne rýchly postup farebných škvŕn na papieri v oblasti medzi štartom (bodom nanesenia vzorky) a čelom postupujúceho rozpúšťadla. Charakteristickou kvalitatívnou črtou každej zložky vzorky je poloha jej škvrny, jej správanie a vzhľad pri detekcii. Veľkosť a intenzita signálu (farebnosť) škvrny má vzťah ku množstvu analyzovanej látky v škvrne (kvantitatívna črta).

Technika papierovej chromatografie

Pri vzlínaní - prietoku mobilnej fázy papierom, dochádza k chromatografickému procesu. Vzorka sa nanesie na grafitovou ceruzkou naznačenú čiaru (2 cm od spodného okraja archu papiera) na štart obyčajne v podobe malej škvrny s priemerom 1 mm až 3 mm.
Na jednom archu papiera je možné paralelne separovať zložky až 10 vzoriek. Po odparení rozpúšťadla sa papier spodným koncom ponorí do mobilnej fázy tak, aby bol 1 cm spodnej časti papiera ponorený a štartová čiara s nanesenými škvrnami vzoriek bola 1 cm nad hladinou mobilnej fázy. Keď čelo mobilnej fázy dosiahne potrebnú vzdialenosť (minimálne 10cm), papier sa vyberie z vyvíjacej komory, označí sa čelo mobilnej fázy a po vysušení priamo vyhodnotíme výsledok separácie farebných analytov.

Pre každý analyt je na chromatograme charakteristická jeho poloha, ktorá zohľadňuje pôsobenia rozdielov síl cez rozdeľovacie koeficienty a je vyjadrená hodnotou R_F (retardation factor). Je to pomer vzdialenosti stredu škvrny od štartu (a) a vzdialenosti čela mobilnej fázy od štartu (b):

Obr. 1: Znázornenie výpočtu hodnoty R_F. Š - (štart) miesto nanesenia vzorky, Č - čelo mobilnej fázy

Hodnoty R_F sa pohybujú od 0 do 1. Pre látky, ktoré zostávajú blízko štartu, sa R_F blíži k nule. Pre látky, ktoré sa pohybujú nezadržané stacionárnou fázou takmer s čelom mobilnej fázy sa R_F blíži k jednej.

Chromatografický papier

Chromatografický papier je veľmi čistý celulózový papier, ktorý musí spĺňať viaceré podmienky:

- relatívne rýchly prietok mobilnej fázy umožňujúci rýchlu analýzu,

- dostatočná homogenita, kapacita a mechanická pevnosť,

- malý obsah nečistôt.

Nedodržanie týchto podmienok môže mať za následok neprimerane dlhú analýzu, nerovnorodý a ťažko vyhodnotiteľný tvar škvŕn, predčasné ukončenie experimentu a problémy s detekciou separovaných látok. Pre účely papierovej chromatografie sa vyrábajú špeciálne chromatografické papiere líšiace sa hrúbkou (0,15 mm až 0,5 mm), hustotou (plošná hmotnosť 85 až 180 g m^-2), homogenitou kladenia vlákien a čistotou (napr. Whatman, Schleicher-Schull). K ideálnemu chromatografickému papieru sa blížia niektoré druhy filtračného papiera, ktoré je možné tiež použiť po premytí papiera, odstránení prípadných nečistôt a vysušení.

Pomôcky a chemikálie

Chromatografický alebo filtračný papier, vyvíjacia nádoba, kadička, deionizovaná voda, chlorid sodný čistý, nanášacia kapilára (2 µl), individuálne štandardy farbív, zmes vodorozpustných farbív v roztoku, rôzne farebné fixky.

 

Úlohy

1. Porovnať separáciu jednotlivých farbív za použitia rôznych mobilných fáz.
2. Vyhodnotiť R_F hodnoty separovaných farbív a porovnať ich s R_F hodnotami vybraných štandardov vodorozpustných farbív. Na základe vyhodnotenia priradiť odpovedajúce štandardy k jednotlivým fixkám.
3. Diskutovať vzťah medzi farbou fixky a počtom a kvalitou farbív v nej obsiahnutých.

Pracovné podmienky a postup

Na papier (veľkosť papiera prispôsobte vyvíjacej nádobe – cca 18,5 x 15,0 cm) narysujte grafitovou ceruzkou vodorovnú čiaru vo vzdialenosti 2 cm od spodného okraja (Štart) a na ňu vyznačte v 1,5 – 2,0 cm odstupoch od ľavého okraja papiera miesta pre nanášanie vzoriek a štandardov. Na jednotlivé body postupne naneste vzorky fixiek a štandardov farbív tak, aby priemer škvrny nebol väčší ako 2 mm. Približne 0,5 cm pod horným okrajom papiera naneste vzorky fixiek a štandardov farbív v identickom poradí ako na spodnej časti papiera a jednotlivé škvrny si popíšte. Škvrny na hornom okraji papiera sú referenčné škvrny umožňujúce diskutovať výsledok delenia s pôvodným vzhľadom farby fixky. Vložte pripravené chromatografické papiere do vyvíjacej nádoby s mobilnou fázou a pozorujte separáciu. Mobilnou fázou je deionizovaná voda resp. 3 % roztok NaCl alebo NaNO₃ (podľa pokynov vyučujúceho). Hladina mobilnej fázy by mala siahať približne 1 cm od spodu nádoby. Keď čelo mobilnej fázy dosiahne potrebnú vzdialenosť (minimálne 10 cm od Štartu), papier z vyvíjacej nádoby vyberte, označte čelo mobilnej fázy a po vysušení priamo vyhodnoťte výsledok separácie farebných analytov.

STEM stratégia